гидролиз в объёме

Artyom Timeyev (asker) Oct 10, 2017:

Получается, что это "renatured antibody", "restored antibody". Интересно, зачем такая сложная последовательность операций перед enzymatic digestion. Чтобы убрать олигосахариды и сделать белок "чистым", без добавок?

Natalie Oct 9, 2017:

В переводе это "в объеме" в принципе можно просто опустить, поскольку из контекста ясно, что протеолиз происходит в объеме 500 мкл в эппендорфке, а не на колонке.

Artyom Timeyev (asker) Oct 9, 2017:

Спасибо большое! Текст большой, я все ждал ответов на мои вопросы от автора, и даже не обратил внимание на то, что есть описание процедуры. )) Ответы запаздывают, и стал сам разбирать сложные места потихоньку.

Natalie Oct 9, 2017:

Спасибо - примерно как я и думала. Белок в присутствии 6М гуанидингидрохлорида денатурирован, т.е. что бы с ним ни делали, он будет выпадать в осадок. Дальше после разных манипуляций колонку промывали буфером, содержащим 2М мочевину, что приводило к ренатурации белка в том растворе, который сходил с колонки. Так что когда в эппендорф добавляли гидролитические ферменты, то гидролиз как раз и происходил не "на дне пробирки" (в осадке), а во всем объеме образца (500 мкл). Вот в этом и заключается смысл.

Artyom Timeyev (asker) Oct 9, 2017:

Natalie, до трипсина и хемотрипсина очень много всего сделали:
"Образец смешивали с раствором 0,1 % муравьиной кислоты,и затем прибавляли 2 мкл раствора 1 мкг/мкл PNGase F , инкубировали. Через 18 ч объем раствора доводили до 100 мкл буфером, содержащим 6 М гуанидин гидрохлорид, 1 мМ ЭДТА, 250 мМ Трис.
Для восстановления дисульфидных связей к каждому образцу прибавляли 2 мкл 500 мМ раствора дитиотреитола до его конечной концентрации в растворе 10 мМ и инкубировали.
После этого к каждому образу прибавляли 4,08 мкл 500 мМ раствора йодацетамида до его конечной концентрации в растворе 20 мМ, для алкилирования свободных цистеинов.
Реакцию алкилирования останавливали добавлением 2 мкл 500 мМ раствора дитиотреитола.
Проводили смену буфера на колонках Zeba. Удаляли заглушку с нижней части колонки, приоткрывали крышку, помещали в эппендорф вместимостью 1,5 мл и центрифугировали в течение 1 мин при центростремительном ускорении в 1500 g при комнатной температуре. Затем колонку двукратно промывали 300 мкл буфера (2 М мочевина, 250 мМ Трис) при центростремительном ускорении 1500. Фугат переносили в эппендорф вместимостью 500 мкл. Аликвоты обрабатывали ферментами трипсином и химотрипсином.

Natalie Oct 9, 2017:

Артем, а что с этими антителами было ДО того? В какой они были форме?

Andrey Svitanko Oct 9, 2017:

Тут наверняка ошибка в исходнике. Что-то пропущено. Либо в объеме чего-то, либо в замкнутом объеме либо в объеме и он далее указан.