This site uses cookies.
Some of these cookies are essential to the operation of the site,
while others help to improve your experience by providing insights into how the site is being used.
For more information, please see the ProZ.com privacy policy.
This person has a SecurePRO™ card. Because this person is not a ProZ.com Plus subscriber, to view his or her SecurePRO™ card you must be a ProZ.com Business member or Plus subscriber.
Affiliations
This person is not affiliated with any business or Blue Board record at ProZ.com.
Dutch to English: ABC transporters from Botrytis cinerea in biotic and abiotic interactions, Summary General field: Science Detailed field: Biology (-tech,-chem,micro-)
Source text - Dutch Botrytis cinerea is the causal agent of grey mould disease on a wide variety of crops. It is a serious
pathogenic fungus that is difficult to control since resistant plant are hardly available and it readily
develops resistance to fungicides of various chemical classes. The life cycle of the pathogen,
mechanisms of pathogenicity, disease control and fungicide resistance are described in Chapter 1.
Chapter 2 describes how active efflux systems with low specificity can contribute to
decreased sensitivity of B. cinerea to various fungitoxic compounds. The major representatives of
these export systems are proteins belonging to the ATP-binding cassette (ABC) and major
facilitator superfamily (MFS) transporters. These proteins can actively export fungitoxic
compounds from the cytoplasm and lower the intracellular concentration to non-toxic levels. The
energy required for this transport is either derived directly from hydrolysis of ATP by ABC
transporters, or indirectly, from the proton-motive force, by MFS transporters. In Saccharomyces
cerevisiae, several transporter proteins involved in pleiotropic drug resistance have been described.
However, reports on ABC transporters from filamentous fungi are limited.
The aim of this study was to investigate how transporters from B. cinerea protect this fungus
against natural and synthetic fungitoxic compounds. A fragment of the well described ABC
transporter gene PDR5 from S. cerevisiae was used to screen a genomic library of B. cinerea for
homologous sequences. This screening revealed two candidate ABC transporter genes, BcatrA and
BcatrB. Chapter 3 describes the cloning and initial characterisation of BcatrB. This gene indeed
encodes a PDR-like ABC transporter, which consists of 1439 amino acids. Expression of BcatrB is
upregulated upon incubation with various fungitoxic compounds. Gene-replacement mutants
display increased sensitivity to the phenylpyrrole fungicide fenpiclonil and the grapevine
phytoalexin resveratrol, implying a role in both fungicide resistance and virulence.
Twelve ABC and three MFS genes were found in a library of expressed sequence tags
(ESTs), containing 6000 clones of cDNA from mycelium of a B. cinerea strain grown under
nitrogen-starvation. Chapter 4 describes the cloning of the corresponding genomic fragments from
strain B05.10. The expression of BcatrA, BcatrB, and the transporter genes from the EST library
was analysed in untreated mycelium and in mycelium exposed to fungicides from various chemical
classes. Many compounds differentially induced expression of the ABC and MFS transporter genes.
Most striking results were obtained for BcatrB, which is strongly induced by the phenylpyrrole
fungicide fludioxonil and overexpressed in the phenylpyrrole resistant strain CH1.7. BcatrB
expression strongly correlates with the sensitivity of the strains tested and their ability to secrete the
compound.
Chapter 5 and 6 describe the expression of the ABC and MFS transporter genes after
treatment with azole fungicides. BcatrD is the strongest induced gene in wild-type strains B05.10
and B3 upon treatment with the azole oxpoconazole and has high basal levels of expression in the
azole-resistant strains G25 and G66. Studies with these mutants indicate that BcatrD is a
determinant in the sensitivity of B. cinerea to azole fungicides. Strains with higher expression levels of BcatrD displayed reduced sensitivity and lower accumulation levels of oxpoconazole.
Overexpression mutants of BcatrD in strain B05.10 also accumulated less oxpoconazole and
displayed relatively low azole sensitivity. BcatrD replacement mutants in B05.10 showed the
opposite phenotype.
The intrinsic role of ABC transporters during saprophytic growth and pathogenesis was
studied by expression analysis of ABC and MFS transporter genes after treatment with plant
defence compounds and antibiotics (Chapter 7). BcatrB expression in particular was induced by
plant defence compounds, such as camptothecin, eugenol, psoralen, resveratrol and rishitin. BcatrB
gene-replacement mutants showed increased sensitivity to eugenol but virulence on basil, a B.
cinerea host plant that can produce eugenol, was not different from the wild type.
Studies on the role of BcatrA and BcatrB in virulence are described in more detail in
Chapter 8. Virulence of gene-replacement mutants was compared with that of the parental strain
B05.10 on Leguminous and Solanaceous host plants. No significant reduction in virulence of the
mutant strains was observed. These results indicate that the multidrug exporter BcatrB is not
essential for virulence on the tested host plants. The BcatrB mutants were slightly more virulent
than the parental isolate on tomato (Lycopersicon esculentum) cv. Vollendung but not on
transgenic, resveratrol-producing lines of this cultivar nor on tomato cv. Moneymaker Cf4. An
explanation for this remarkable cultivar-dependent difference is not readily available.
Chapter 9 describes a role for ABC transporters in the protection of B. cinerea against
antibiotics from competing microorganisms. Phenazine-1-carboxylic acid and phenazine-1-
carboxamide, broad-spectrum antibiotics produced by Pseudomonas spp., strongly induced
expression of BcatrB, and BcatrB gene-replacement mutants were significantly more sensitive to
these antibiotics than their parental strain. Phenazines also interfered with the accumulation of
[14C]fludioxonil, a phenylpyrrole fungicide known to be transported by BcatrB, indicating that
BcatrB also transports these antibiotics. Pseudomonas strains producing phenazines displayed a
stronger antagonistic activity towards BcatrB mutants than to the parental B. cinerea strain.
Collectively, these results indicate that fungal ABC transporters can play an important role in
antibiotic-mediated interactions between bacteria and fungi in plant-associated environments, with
considerable consequences for biocontrol strategies in agriculture.
In conclusion, we found that B. cinerea possesses several ABC and MFS transporters, which
can be differentially induced by natural fungitoxic compounds and fungicides. BcatrD proved to be
involved in protection against azole fungicides and BcatrB against plant defence compounds,
phenylpyrrole fungicides and phenazine antibiotics. We predict that further functional analysis of
MFS and ABC transporters will unravel additional physiological functions in saprophytic growth,
virulence and multidrug resistance to fungicides.
Translation - English Botrytis cinerea veroorzaakt de grauwe schimmelziekte op een groot aantal gewassen. Het is een
pathogene schimmel met een hoog aanpassingsvermogen die moeilijk te bestrijden is, vooral omdat
er weinig resistentie tegen deze schimmel in genetische bronnen aanwezig is en de schimmel
makkelijk resistentie ontwikkelt tegen chemisch niet-verwante fungiciden. De levenscyclus van de
schimmel, pathogenese, gewasbescherming en resistentie tegen fungiciden worden in hoofdstuk 1
beschreven.
Hoofdstuk 2 beschrijft de wijze waarop actieve efflux systemen met een lage specificiteit
kunnen bijdragen aan verminderde gevoeligheid van B. cinerea voor fungitoxische verbindingen.
De belangrijkste voorbeelden van deze exportsystemen zijn eiwitten die behoren tot de
superfamilies van ATP-binding cassette (ABC) en “major facilitator superfamily” (MFS)
transporters. Deze eiwitten kunnen actief fungitoxische verbindingen uit het cytoplasma
verwijderen en verlagen daarmee de intracellulaire concentratie tot een sublethaal niveau. De
energie die benodigd is voor transport wordt door ABC transporters direct gegenereerd door
hydrolyse van ATP en door MFS transporters verkregen uit de protonen gradient. Transporteiwitten
met een rol in pleiotrope resistentie tegen fungitoxische verbindingen zijn vooral beschreven in
Saccharomyces cerevisiae. Informatie over ABC transporters in filamenteuze schimmels is
daarentegen zeer beperkt.
Het doel van dit onderzoek betreft een functionele analyse van transporters in B. cinerea bij
bescherming tegen fungitoxische verbindingen van natuurlijke en synthetische oorsprong. Een
fragment van het gen voor de goed gedocumenteerde ABC transporter PDR5 uit S. cerevisiae is
gebruikt voor het opsporen van homologe sequenties in een genomische bank van B. cinerea. Door
middel van heterologe hybridisatie zijn twee potentiële ABC transporter genen gevonden, BcatrA
en BcatrB. Hoofdstuk 3 beschijft de klonering en initiële karakterisering van BcatrB. Het eiwit waar
dit gen voor codeert is inderdaad een ABC transporter en heeft een lengte van 1439 aminozuren. De
expressie van BcatrB werd verhoogd na incubatie van mycelium met diverse fungitoxische
verbindingen. Genvervangingsmutanten vertoonden verhoogde gevoeligheid voor het fenylpyrrool
fungicide fenpiclonil en het fytoalexine resveratrol uit druif, hetgeen een rol van BcatrB in zowel
resistentie tegen fungiciden als in virulentie doet veronderstellen.
In een bibliotheek van “expressed sequence tags” (ESTs) met 6000 cDNA klonen van B.
cinerea, gekweekt onder stikstof-limiterende omstandigheden, werden twaalf ABC en drie MFS
genen gevonden. Hoofdstuk 4 beschrijft de klonering van de corresponderende genomische
fragmenten uit isolaat B05.10. De expressie van BcatrA, BcatrB en de transporter genen ontdekt in
de EST bibliotheek werd bestudeerd in onbehandeld mycelium en in mycelium blootgesteld aan
fungiciden uit verschillende chemische groepen. Veel stoffen induceerden op verschillende wijze de
expressie van ABC en MFS transporter genen. De meest opvallende resultaten werden gevonden
voor BcatrB, dat sterk wordt geïnduceerd door het fenylpyrrool fungicide fludioxonil en een
verhoogd expressieniveau vertoont in het fenylpyrrool-resistente isolaat CH1.7. BcatrB expressie
vertoonde een hoge correlatie met de gevoeligheid van de geteste isolaten en hun vermogen om
deze verbinding uit te scheiden.
Hoofdstuk 5 en 6 beschrijven de expressie van de geïdentificeerde ABC en MFS transporter
genen na behandeling met azool fungiciden. BcatrD werd het sterkst geïnduceerd in de wild-type
isolaten B05.10 and B3 na behandeling met het azool fungicide oxpoconazool en heeft een hoog
basaal expressie niveau in de azool-resistente isolaten G25 en G66. Studies met deze mutanten
geven aan dat BcatrD een belangrijke rol speelt in de gevoeligheid van B. cinerea voor azool
fungiciden. Isolaten die BcatrD sterk tot expressie brengen vertoonden verminderde gevoeligheid
en lagere accumulatieniveaus voor oxpoconazole. BcatrD-overexpressiemutanten van isolaat
B05.10 accumuleerden ook minder oxpoconazool en bezaten eveneens een verminderde
gevoeligheid voor azolen. BcatrD-genvervangingsmutanten van B05.10 vertoonden juist het
tegenovergestelde phenotype.
De natuurlijke rol van ABC transporters tijdens saprofytische groei en pathogenese werd
bestudeerd door expressie-analyse van ABC en MFS transporter genen na behandeling met
plantenafweerstoffen en antibiotica (Hoofdstuk 7). Vooral de expressie van BcatrB werd sterk
geïnduceerd door plantenafweerstoffen, zoals camptothecine, eugenol, psoralen, resveratrol en
rishitine. BcatrB genvervangingsmutanten vertoonden verhoogde gevoeligheid voor eugenol, maar
de virulentie op basilicum, een waardplant van B. cinerea die eugenol kan produceren, was
vergelijkbaar met het wild type.
Studies naar de rol van BcatrA en BcatrB in virulentie zijn verder beschreven in Hoofdstuk
8. De virulentie van genvervangingsmutanten is vergeleken met die van het moederisolaat B05.10
op waardplanten uit de families der Leguminosae en Solanaceae. Er werd geen significante
vermindering in virulentie van de mutanten geconstateerd. Deze resultaten geven aan dat de
multidrug transporter BcatrB niet van essentieel belang is voor de virulentie op deze waardplanten.
De BcatrB genvervangingsmutanten waren wel enigszins virulenter dan B05.10 op de
tomatencultivar Vollendung maar niet op transgene, resveratrol-producerende lijnen van deze
cultivar noch op tomatencultivar Moneymaker Cf4. Een verklaring voor dit opmerkelijke cultivarafhankelijke
verschil is vooralsnog niet beschikbaar.
Hoofdstuk 9 beschrijft de rol van ABC transporters in de bescherming van B. cinerea tegen
antibiotica van concurrerende microorganismen. Fenazine-1-carboxylzuur en fenazine-1-
carboxamide, breed-spectrum antibiotica geproduceerd door Pseudomonas spp., bleken de expressie
van BcatrB sterk te induceren, en BcatrB genvervangingsmutanten waren significant gevoeliger
voor deze antibiotica dan de ouderstam. Fenazinen beïnvloedden ook de accumulatie van
[14C]fludioxonil, een fenylpyrrool fungicide dat door BcatrB wordt getransporteerd. Deze resultaten
tonen aan dat fenazine antibiotica ook door BcatrB getransporteerd kunnen worden. De
antagonistische activiteit van fenazine producerende Pseudomonas stammen was sterker tegen
BcatrB genvervangingsmutanten dan tegen het B. cinerea moederisolaat. Al met al, geven deze
resultaten aan dat ABC transporters van schimmels een belangrijke rol kunnen spelen in antibiotica-afhankelijke interacties tussen bacterieën en schimmels in plant gerelateerde ecosystemen, hetgeen
aanzienlijke consequenties kan hebben voor biologische bestrijding in land- en tuinbouw.
Samengevat, hebben we gevonden B. cinerea ABC en MFS transporters bezit, die op
verschillende wijzen geïnduceerd worden door fungiciden en natuurlijke fungitoxische
verbindingen. BcatrD blijkt betrokken te zijn bij bescherming tegen azool fungiciden en BcatrB
tegen plantenafweerstoffen, fenylpyrrool fungiciden en fenazine antibiotica. We verwachten dat
verdere functionele analyse van ABC en MFS transporters meer fysiologische functies bij
saprofytische groei, pathogenese en multidrug resistentie zal identificeren.
More
Less
Experience
Years of experience: 29. Registered at ProZ.com: Jul 2009.